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Comment utiliser la colle de séparation? - partie 1

Nombre Parcourir:0     auteur:Éditeur du site     publier Temps: 2022-09-07      origine:Propulsé

Comment utiliser colle de séparation?

Transfert de membrane Western blot

Sous l'action du courant, la protéine est transférée du gel vers le porteur solide (membrane).

Sélection de la membrane: les matériaux en phase solide couramment utilisés dans l'impression comprennent la membrane NC, le DBM, le DDT, la membrane en nylon, le PVDF, etc. Nous choisissons le PVDF (fluorure de polyvinylidène), qui a une meilleure adsorption des protéines, une résistance physique et une meilleure compatibilité chimique. Il existe deux spécifications: Immobilon-P (0,45UM) et Immobilon PSQ (0,2UM pour MW <20KDA).

Une méthode semi-sèche

C'est-à-dire que la combinaison intercouche de gel est placée entre le papier filtre avec le tampon de transfert, et le courant est effectué via le tampon adsorbé sur le papier filtre pour atteindre l'effet de transfert. Parce que le courant agit directement sur la colle du film, les conditions de transfert sont relativement dures, mais le temps de transfert est court et l'efficacité est élevée.

(1) sélection des conditions expérimentales

Le courant est 1MA-2MA / CM2, et nous utilisons généralement 100 mA / membrane. Le temps de transfert peut être sélectionné en fonction de la taille de la molécule de protéine cible et de la concentration de gel, et peut être ajusté de manière appropriée en fonction de la situation réelle.

Taille moléculaire des protéines cibles (KDA), concentration de gel et temps de transfert

80 --- 140 8% 1.5-2.0

25 --- 80 10% 1.5

15—40 12% 0,75

<20 15% 0,5

(2) opération expérimentaleFournisseur de tube de gel sérique - Smail

(1) Préparation du papier filtre et de la membrane (la préparation doit être démarrée 20 minutes avant l'électrophorèse).

A. Vérifiez s'il y a suffisamment de tampons de transfert, qui ne sont pas préparés immédiatement.

B. Vérifiez s'il y a du papier filtre et de la membrane de bonne taille.

C. plonger la membrane dans le méthanol pendant environ 1 à 2 minutes. Puis transféré dans le tampon de transfert.

D. trempez le papier filtre adhésif approprié et le papier filtre à membrane dans le tampon de transfert respectivement.

Combien de temps la membrane PDVF doit-elle tremper dans le méthanol lors de la saisie du tampon de transfert?

Le PVDF est hydrophobe et il est difficile de tremper dans le tampon de transfert. Après le traitement au méthanol, il est plus facile de tremper. Le prétraitement du PVDF consiste à tremper et à l'activer avec du méthanol, puis à le laver deux fois avec de l'eau distillée après avoir trempé soigneusement. Le but d'utiliser des bulles de méthanol est d'activer les groupes chargés positivement sur la membrane PVDF et de faciliter la liaison avec des protéines chargées négativement.

Les gens l'utilisent généralement pendant 5 à 20 minutes. Il peut être trempé en même temps que de prendre la colle, et on estime que cela prendra environ 5 minutes. L'effet n'est pas mauvais. Dans le passé, certains amis Web ont affiché que le temps de traitement n'avait pas beaucoup d'importance, mais la clé était la qualité du film. C'est vrai. Tant que la membrane est complètement trempée, ça devrait être OK.

La spécification PVDF de Hybond se lit comme suit: "PRE WEY la membrane dans 100% de métanol (10 secondes) ". Je crois comprendre qu'il est normal de tremper pendant au moins 10 secondes. En fait, il est normal de tremper pendant 10 secondes ou 10 minutes.

(2) transfert

A. Posez le papier filtre inférieur sur l'instrument de transfert électrique. Généralement, trois couches sont utilisées.

B. Posez la membrane sur le papier filtre contre la membrane, faites attention à ne pas avoir des bulles entre la membrane et le papier filtre, et versez un tampon de transfert sur la membrane pour garder la membrane humide.

C. décoller la colle, retirer le gel de pile et le déplacer soigneusement sur le film.

D. Coupez le coin supérieur gauche du film et marquez la position de colle sur le film avec un crayon.

E. Couvrez un morceau de papier filtre contre la colle sur la colle. Versez un tampon de transfert et posez deux morceaux de papier filtre.

F. Installez l'instrument de transfert électrique et sélectionnez le courant et le temps requis en fonction des besoins.

G. Pendant le processus de transfert, le changement de tension doit être observé à tout moment et toute anomalie doit être ajustée dans le temps.

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